Nowy kod życia
Thomas Gingeras nie zamierzał wywracać do góry nogami podstawowych prawd na temat działania ludzkiego organizmu. W roku 2012 ten genetyk, obecnie zatrudniony w Cold Spring Harbor Laboratory w stanie Nowy Jork, należał do grupy kilkuset naukowców próbujących opracować kompendium funkcji ludzkiego DNA. Projekt ten nazwano ENCODE, co stanowi akronim pełnej nazwy Encyclopedia of DNA Elements. Mniej więcej 10 lat wcześniej zidentyfikowano w całości niemal 3 mld elementów budulcowych DNA, składających się na ludzki genom. Gingeras i inni naukowcy pracujący w ramach ENCODE próbowali określić, za co odpowiada całe to DNA.
Większość biologów w tamtym czasie zakładała, że gros DNA nie ma za wiele do roboty. Pierwsi naukowcy dokonujący mapowania genomu szacowali, że może 1–2% naszego DNA stanowią geny zgodne z ich klasyczną definicją: fragmenty genomu kodujące białka – woły robocze naszego organizmu, które dostarczają tlen do narządów, budują mięśnie serca i komórki mózgu, krótko mówiąc robią wszystko to, czego potrzebujemy, aby żyć. Uważano, że podstawowym zadaniem genomu jest wytwarzanie białek. Geny osiągają ten cel, przekazując instrukcje do ich produkcji poprzez cząsteczki matrycowe, tak zwane mRNA, które wędrują następnie do struktur wewnątrzkomórkowych wytwarzających białka. A co z resztą DNA tworzącego genom? Jak mówi Gingeras, „odcinki kodujące białka” miały być „otoczone oceanami sekwencji pozbawionych biologicznych funkcji”. Innymi słowy, było to w większości śmieciowe DNA.
Kiedy więc w kilku artykułach opublikowanych w 2012 roku w „Nature” Gingeras i reszta zespołu ENCODE donieśli, że od czasu do czasu co najmniej 75% genomu ulega transkrypcji do RNA, wywołało to konsternację. Prace nad projektem ENCODE, w którym wykorzystywano techniki pozwalające na mapowanie aktywności RNA w różnych częściach genomu, rozpoczęły się w 2003 roku, a wstępne wyniki uzyskano w 2007 roku. Jednak dopiero pięć lat później stało się jasne, jak duży zakres mają te procesy transkrypcyjne. Skoro tylko 1–2% tego RNA koduje białka, to czemu ma służyć cała reszta? Naukowcy widzieli, że niektóre z tych cząsteczek mają kluczowe zadania, takie jak włączanie lub wyłączanie genów. Inne ich funkcje wymagały dopiero zbadania. Nikt nie wyobrażał sobie jednak, że trzy czwarte naszego DNA może prowadzić do powstawania RNA, nie mówiąc już o tym, aby było ono w jakikolwiek sposób użyteczne.
Niektórzy biolodzy powitali tę informację ze sceptycyzmem ocierającym się o oburzenie. Zespół ENCODE oskarżano o rozdmuchiwanie swoich odkryć. Część krytyków twierdziła, że większość z tego RNA powstawała w sposób przypadkowy, ponieważ enzymy wytwarzające RNA, wędrujące wzdłuż genomu, w mało wybiórczy sposób odczytują konkretne fragmenty DNA.
Wygląda jednak na to, że zespół ENCODE miał co do zasady rację. Dziesiątki innych grup badawczych, przyglądających się aktywności ludzkiego genomu, również stwierdziły, że znaczna część naszego DNA masowo produkuje „niekodujące” RNA. Nie koduje ono białek, tak jak mRNA, natomiast wiąże się z innymi cząsteczkami, realizując pewne biochemiczne zadania. Do roku 2020 ogłoszono, że w ramach projektu ENCODE zidentyfikowano około 37 600 niekodujących genów – czyli fragmentów DNA zawierających instrukcje dla cząsteczek RNA, które nie kodują białek. To niemal dwa razy więcej niż liczba genów kodujących białka. Inne szacunki wskazują na bardzo rozbieżne liczby, od około 18 tys. do niemal 96 tys. Niektórzy nadal zachowują sceptycyzm, jednak wśród biologów są także entuzjaści, jak Jeanne Lawrence i Lisa Hall z Chan Medical School na University of Massachusetts. W komentarzu opublikowanym w 2024 roku w czasopiśmie „Science” ten duet odnosi się do nowych wyników jako do części „rewolucji RNA”.
Rewolucyjność tych odkryć wynika z funkcji tego niekodującego RNA, nazywanego w skrócie ncRNA (od noncoding RNA). Wydaje się, że w znacznej części odpowiada ono za regulację aktywności genów – nie tylko ich zwykłe włączanie lub wyłączanie, ale także precyzyjne sterowanie tą aktywnością. Tak więc chociaż część genów zawiera przepisy na budowę białek, ncRNA może kontrolować aktywność tych genów i ostatecznie decydować o tym, czy dojdzie do wytwarzania tych białek. Jest to dalekie od podstawowej narracji biologii, obowiązującej od czasu odkrycia podwójnej helisy DNA około 70 lat temu, która dotyczyła wyłącznie powstawania białek na podstawie informacji zapisanej w DNA. „Wygląda na to, że popełniliśmy podstawowy błąd w rozumieniu natury programowania genetycznego” – stwierdzili biolog molekularny Kevin Morris z Queensland University of Technology i John Mattick z University of New South Wales w Australii w artykule z 2014 roku.
Kolejne ważne odkrycie wskazuje, że niektóre z cząsteczek ncRNA odgrywają najwyraźniej rolę w rozwoju chorób, na przykład regulując procesy komórkowe biorące udział w powstawaniu niektórych typów raka. Naukowcy badają zatem możliwości opracowania leków działających na takie ncRNA albo przeciwnie – wykorzystania ncRNA jako leków. Jeśli na przykład jakiś gen koduje białko, które pomaga komórkom raka rosnąć, cząsteczki ncRNA wyłączające ten gen mogłyby wspomagać leczenie tego nowotworu.
Parę przykładów niekodującego RNA znamy od kilku dziesięcioleci, wydawało się jednak, że odgrywają one pewną rolę w procesach wytwarzania białek. Na przykład zaledwie kilka lat po tym, jak Francis Crick, James Watson i ich kilkoro współpracowników wywnioskowali, jaka jest struktura DNA, naukowcy odkryli, że tzw. transportujące RNA chwyta aminokwasy, które są następnie ze sobą łączone, tworząc białka.
Jednak w latach 90. badacze zdali sobie sprawę z tego, że ncRNA może realizować funkcje niezwiązane w żaden sposób z wytwarzaniem białek. Te nowe działania poznano dzięki wysiłkom zmierzającym do zrozumienia procesu inaktywacji X, w którym jeden z dwóch chromosomów X przenoszonych przez samice zostaje wyciszony, a około 1000 zawartych w nim genów (u ludzi) zostaje wyłączonych. Wyglądało na to, że procesem tym steruje gen nazwany XIST. Mimo to próby znalezienia białka XIST kończyły się zawsze niepowodzeniem.
Jak się okazuje, wynikało to z faktu, że gen ten nie działa za pośrednictwem białka, ale poprzez produkcję długiej cząsteczki niekodującego RNA (long noncoding RNA, lncRNA). Takie RNA ma zwykle długość ponad 200 nukleotydów – elementów budulcowych DNA i RNA. Wykorzystując specjalną technikę mikroskopową, tzw. fluorescencyjną hybrydyzację in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), Lawrence wraz ze współpracownikami wykazała, że to RNA owija się wokół jednego z chromosomów X (losowo wybranego w każdej komórce) i pobudza trwałe zmiany, wyciszające geny. „Był to pierwszy dowód na to, że lncRNA ma jakieś zadania – mówi Lawrence – i było to całkowitym zaskoczeniem”.
Wytwarzanie ncRNA na podstawie XIST nie jest jednak niczym aż tak wyjątkowym. W pierwszych latach XXI wieku stało się jasne, że transkrypcja niekodujących sekwencji DNA to zjawisko powszechne. Na przykład w 2002 roku zespół pracowników firmy biotechnologicznej Affymetrix z Santa Clara w stanie Kalifornia, którym kierował zatrudniony tam wówczas Gingeras, stwierdził że transkrypcji ulega znacznie większa część ludzkich chromosomów 21 i 22 niż tylko obszary kodujące białka.
Jednak dopiero po opublikowaniu wyników projektu ENCODE w 2012 roku nie można już było ignorować tego ncRNA. Peter Stadler, specjalista bioinformatyki z Universität Leipzig w Niemczech, uważa że niechęć wobec tych odkryć wynikała częściowo z faktu, że były one postrzegane jako niepotrzebne komplikowanie sytuacji. „Społeczność biologów sądziła, że wiadomo już, jak działają komórki, więc odkrycie [ncRNA] było raczej irytujące”, mówi. Co więcej, dowodziło, że prostsze organizmy nie zawsze mogą stanowić wiarygodne źródło wiedzy na temat biologii człowieka. Bakterie zawierają dużo mniej ncRNA, tymczasem badania nad nimi przez długi czas kształtowały sposób myślenia o regulacji aktywności genów.
Ale teraz nie ma już odwrotu: opisano wiele tysięcy ludzkich cząsteczek lncRNA, a Mattick podejrzewa, że w rzeczywistości jest ich ponad 500 tys., choć tylko dla nielicznych dowiedziono swoistych funkcji. Bez odpowiedzi pozostaje pytanie, ile z nich faktycznie odgrywa jakąś rolę. „Osobiście uważam, że każda z tych cząsteczek RNA ma indywidualną funkcję” – mówi Lawrence. Niektóre mogą jednak działać w grupach, regulując funkcje innych cząsteczek.
Nadal trwają także dyskusje nad tym, w jaki sposób cząsteczki lncRNA pełnią swoje funkcje regulujące. Według jednej z hipotez pomagają one przy tworzeniu tzw. kondensatów: gęstych skupisk płynu, zawierających wiele różnych cząsteczek regulujących. Uważa się, że kondensaty zapewniają zgromadzenie wszystkich uczestników tego procesu w jednym miejscu na dostatecznie długi czas, aby mogły wspólnie wykonać swoje zadania. Inna hipoteza mówi, że lncRNA wpływa na strukturę chromatyny – kompleksu złożonego z DNA i białek, który tworzy włókna chromosomów w jądrze komórkowym. Struktura chromatyny wpływa na dostęp do poszczególnych genów i możliwość ich transkrypcji. Jeśli pewne fragmenty chromatyny są zbyt gęsto upakowane, enzymy odpowiadające za transkrypcję nie są w stanie do nich dotrzeć. „Wydaje się, że niektóre cząsteczki lncRNA wchodzą w skład kompleksów modyfikujących chromatynę” – mówi Marcel Dinger, badacz z dziedziny genomiki z University of Sydney.
Lawrence i Hall podejrzewają, że lncRNA mogą stanowić rusztowanie, pozwalające na porządkowanie innych cząsteczek, na przykład utrzymując wybrane z setek białek wiążących RNA w układzie zapewniającym im możliwość działania. Jedna z cząsteczek lncRNA, nazwana NEAT1, która bierze udział w tworzeniu w jądrze małych kompartmentów, tzw. paracętek (paraspeckles), potrafi związać nawet 60 takich białek. Być może takie rusztowania z RNA mogą powodować, że chromatyna sama będzie ulegała organizacji w określone struktury, co wpływałoby na regulację genów. Rusztowania z RNA mogą wykazywać regularnie powtarzające się moduły i w ten sposób mieć powtarzające się sekwencje, co przez długi czas uznawano za wyznacznik śmieciowego DNA, które jednak ostatnio okazuje się wcale nie takie śmieciowe. Takie spojrzenie na rusztowania z lncRNA potwierdza opublikowane w 2024 roku doniesienie o bogatych w powtórzenia ncRNA w komórkach mózgu myszy, utrzymujących się przez co najmniej dwa lata. W badaniu, jakie przeprowadzili Sara Zocher z German Center for Neurodegenerative Diseases w Dreznie i jej współpracownicy, stwierdzono, że to ncRNA wydaje się niezbędne dla utrzymania fragmentów chromatyny w stanie skondensowanym i uśpionym.
Takie lncRNA to tylko jeden z podtypów rodziny niekodującego RNA. Biolodzy cały czas odkrywają ich nowe rodzaje, które prawdopodobnie pełnią różne funkcje i na różny sposób wpływają na to, co dzieje się z komórkami – a w efekcie z całym ludzkim organizmem.
Niektóre z tych RNA wcale nie są długie, a wręcz zaskakująco krótkie. Ich historia zaczęła się w latach 80., kiedy Victor Ambros, pracujący w ramach stażu podoktorskiego w laboratorium w Massachusetts Institute of Technology, którym kierował biolog Robert Horvitz, badał gen nazwany lin-4 u nicieni Caenorhabditis elegans. Mutacje lin-4 powodowały zaburzenia rozwojowe, polegające na tym, że „komórki powtarzały cały cykl rozwojowy, choć powinny przejść do dalszej fazy”, mówi Ambros, który obecnie pracuje w Medical School na University of Massachusetts. Wyglądało na to, że lin-4 może być swego rodzaju „nadrzędnym elementem sterującym”, kontrolującym czas wchodzenia w kolejne fazy rozwoju.
„Myśleliśmy, że lin-4 będzie genem kodującym białko” – mówi Ambros. Chcąc określić, jaką rolę odgrywa to domniemane białko, Ambros wraz ze współpracownikami sklonowali gen C. elegans i analizowali jego produkt. Stwierdzili, że efekty działania tego genu mogą nie wynikać z działania jakichkolwiek białek, ale bezpośrednio z RNA powstającego z tego genu. Cząsteczka ta zdawała się absurdalnie krótka: liczyła zaledwie 22 nukleotydy, co stanowi zaledwie strzępek, jeśli wziąć pod uwagę ogromne efekty dla rozwoju.
Było to pierwsze poznane mikroRNA (miRNA). Początkowo „myśleliśmy, że jest to cecha swoista dla C. elegans”, mówi Ambros. Jednak w roku 2000 Gary Ruvkun, również odbywający wcześniej staż podoktorski w laboratorium, którym kierował Horvitz, odkrył wraz ze swoimi współpracownikami, że kolejny gen dla miRNA obecny u C. elegans i nazwany let-7, występuje w niemal identycznej postaci u wielu innych organizmów, w tym u kręgowców, mięczaków i owadów. Sugeruje to, że jest to naprawdę stary gen, który „musi istnieć od 600–700 mln lat”, zanim rozdzieliły się te poszczególne linie ewolucyjne, mówi Ambros. Jeśli miRNA jest tak wiekowe, „muszą też być inne jego rodzaje”.
I tak rzeczywiście jest. Do dzisiaj w ludzkim genomie zidentyfikowano ponad 2000 rodzajów miRNA, które zasadniczo pełnią funkcje regulacyjne. Jednym z głównych mechanizmów działania miRNA jest zaburzanie translacji produktu transkrypcji genu, czyli mRNA, do kodowanego przez niego białka. Zazwyczaj miRNA powstaje z dłuższej cząsteczki, liczącej sobie prawdopodobnie około 70 nukleotydów, tzw. pre-miRNA. Cząsteczka ta jest rozcinana przez enzym Dicer na krótsze fragmenty. Te fragmenty, czyli miRNA, migrują w kierunku klasy białek zwanych Argonaute, stanowiących element tzw. kompleksu RISC (RNA-induced silencing complex). Cząsteczki miRNA doprowadzają RISC w stronę mRNA. Powoduje to albo zatrzymanie procesu translacji mRNA do białka, albo jego degradację, co daje taki sam skutek. Działanie regulujące miRNA wpływa na różnorodne procesy, od określania „losu” komórki (konkretnego typu, w jaki się rozwinie) po śmierć komórki i zarządzanie cyklem komórkowym.
Kluczowe informacje na temat możliwości regulowania RNA przez tak krótkie cząsteczki innego RNA pochodzą z badań nad C. elegans, których wyniki w 1998 roku opublikowali biolodzy molekularni Andrew Fire, Craig Mello i ich współpracownicy. Fire i Mello otrzymali za nie w 2006 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny. Odkryli oni, że działaniem RISC kierują nieco inne łańcuchy RNA, tzw. krótkie interferujące RNA (small interfering RNA, siRNA). Proces ten prowadzi do rozcięcia mRNA na pół, co określa się jako interferencję RNA.
Jednak miRNA stanowią pewną zagadkę. Typowa cząsteczka miRNA zawiera zwykle sekwencję pasującą do wielu rodzajów mRNA. W jaki sposób zatem wyciszanie genów może przebiegać w sposób swoisty? Jedna z możliwości zakłada, że miRNA działają w grupach, łącząc siły w celu regulacji działania danego genu. To właśnie różne kombinacje odpowiadają za dopasowanie pomiędzy określonymi genami i ich miRNA.
Dlaczego regulacja genów za pomocą miRNA miałaby przebiegać w tak skomplikowany sposób? Ambros podejrzewa, że może to pozwalać na „ewolucyjną płynność”: różne możliwości współdziałania poszczególnych miRNA i różnorodność potencjalnych obiektów działania każdego z nich zapewniają dużą płynność regulacji genów, a w efekcie uzyskiwanych cech. Daje to organizmom wiele możliwości ewolucyjnych, dzięki czemu mogą się lepiej dostosowywać do zmieniających się okoliczności.
Jedna z klas małych RNA reguluje ekspresję genów poprzez bezpośrednią interferencję z procesem transkrypcji w jądrze komórkowym, co wywołuje degradację mRNA. Ten rodzaj RNA – piRNA (PIWI-interacting RNA) – działa we współpracy z klasą białek nazywanych PIWI Argonaute. Cząsteczki piRNA są aktywne w komórkach linii zarodkowych (gametach), gdzie walczą z „egoistycznymi” sekwencjami DNA, określanymi jako transpozony albo inaczej „skaczące geny”. Są to sekwencje, które mogą wbudowywać swoje kopie w różne miejsca genomu, zaburzając jego funkcjonowanie. Zatem piRNA są „elementem układu odpornościowego genomu”, mówi Julius Brennecke z Institute of Molecular Biotechnology przy Austrian Academy of Sciences. W przypadku sztucznego wyłączenia systemu piRNA „genom gamet ulega całkowitemu poszatkowaniu, a organizm staje się bezpłodny”, mówi.
Inny typ ncRNA, zwany małym jąderkowym RNA (small nucleolar RNA), działa w kompartmentach komórkowych nazywanych jąderkami, gdzie wspomaga modyfikowanie RNA zawartego w rybosomach (komórkowych fabrykach wytwarzających białka), transportującego RNA oraz mRNA. Wszystkie te mechanizmy pozwalają regulować ekspresję genów. Kolejny typ to okrężne RNA: cząsteczki mRNA (występujące przede wszystkim w neuronach), które ulegają sklejeniu w kształt okręgów przed opuszczeniem jądra i wniknięciem do cytoplazmy. Nie wiadomo, czy wszystkie okrężne RNA pełnią istotne funkcje – niektóre z nich być może stanowią jedynie „szum” transkrypcyjny – jednak wyniki badań wskazują, że przynajmniej część może wykazywać działanie regulujące.
Istnieją także RNA, które pomagają w transporcie innych cząsteczek w obrębie komórek i pomiędzy różnymi komórkami (vault RNA), tzw. small Cajal-body-specific RNA, modyfikujące inne ncRNA biorące udział w przetwarzaniu RNA, i wiele innych. Wielość różnych typów ncRNA potwierdza hipotezę Matticka, według której to RNA, a nie DNA, stanowi „silnik obliczeniowy komórki”.
Jeśli rzeczywiście to ncRNA zarządza procesami przetwarzania informacji genetycznych przez komórkę, być może znalazłoby zastosowanie w medycynie. Choroby często wynikają z nieprawidłowego działania komórek na skutek otrzymywania przez nie nieprawidłowych instrukcji z zakresu regulacji: na przykład komórki, które tracą kontrolę nad własnym cyklem wzrostu i podziałów, mogą ulec przemianie w nowotwory. Obecnie w próbach medycznego działania na ncRNA i modyfikacji jego efektów regulacyjnych wykorzystuje się często łańcuchy RNA określane jako oligonukleotydy antysensowne (antisense oligonucleotide, ASO). Są to łańcuchy kwasów nukleinowych o sekwencji komplementarnej do RNA będącego obiektem ich działania, dzięki czemu wiążą się z nim i je wyłączają. ASO są wykorzystywane od końca lat 70. Trudno było jednak wprowadzić je do użytku klinicznego, ponieważ ulegają szybkiej degradacji w komórkach i mają tendencję do wiązania się z niewłaściwymi obiektami, co może mieć dramatyczne skutki.
Mimo to prace nad ASO, które wyłączałyby lncRNA związane z nowotworami, na przykład rakiem płuc czy ostrą białaczką szpikową, są kontynuowane. Inne lncRNA mogą same działać terapeutycznie. Wydaje się na przykład, że lncRNA znane jako MEG3 hamuje rozwój nowotworów. Trwają także badania nad małymi syntetycznymi cząsteczkami, które dałoby się precyzyjniej dopracowywać i skuteczniej wprowadzać do organizmu jako lek niż ASO i które mogłyby wiązać się z lncRNA lub w inny sposób hamować ich interakcje z białkami. Nie zawsze jednak łatwo jest w praktyce uzyskać takie działanie. „Z tego co wiem, na razie żadna z cząsteczek lncRNA, ani będących celem działania, ani lekiem, nie weszła w fazę prac klinicznych” – mówi Gingeras.
Bardziej osiągalne klinicznie może okazać się działanie na mniejsze regulacyjne RNA, na przykład miRNA. Zwykle miRNA wpływają na wiele celów, dzięki czemu mogą osiągać wiele rzeczy jednocześnie. Na przykład miRNA z rodzin miR-15a i miR-16-1 hamuje wzrost nowotworów dzięki działaniu na kilka genów hamujących śmierć komórek (apoptozę, stanowiącą obronę przed rakiem), dlatego są one obecnie badane pod kątem terapii onkologicznej.
Jednak wykorzystanie małych cząsteczek RNA jako leków jest problematyczne, ponieważ wywołują one odpowiedź immunologiczną. Mówiąc precyzyjniej, układ odpornościowy, chcąc chronić nas przed RNA wirusów, zwykle rozpoznaje i atakuje RNA inne niż własne. Jedną ze strategii ochrony terapeutycznego RNA przed reakcją układu odpornościowego i zniszczeniem jest chemiczna modyfikacja jego szkieletu w taki sposób, aby tworzył nienaturalną, „zamkniętą” strukturę pierścieniową, której nie będą mogły łatwo rozpoznać enzymy degradujące.
Niektóre krótkie ASO, działające na RNA, zostały już dopuszczone do użytku klinicznego. Są to na przykład lek inotersen, stosowany w leczeniu amyloidozy, albo golodirsen przeciwko dystrofii mięśniowej Duchenne’a. Naukowcy badają także RNA antysensowne o długości poniżej 21 nukleotydów, ukierunkowane na naturalne regulacyjne miRNA, ponieważ wydaje się, że reakcję immunologiczną wyzwala dopiero RNA o większej długości.
Medycyna oparta na RNA jest jeszcze w powijakach, przede wszystkim dlatego, że rola, jaką ncRNA odgrywa w biologii człowieka, jest znana dopiero od niedawna i nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Im lepiej poznamy ich wszechobecny charakter, tym częściej będziemy zapewne świadkami wykorzystywania RNA do kontroli i poprawy naszego dobrostanu. Nils Walter z Center for RNA Biomedicine na University of Michigan napisał w artykule z początku 2024 roku, że rozkwitający potencjał terapii opartych na RNA „sprawia jedynie, że tym pilniej potrzebujemy poznać funkcje ncRNA”. Dodaje, że skuteczne osiągnięcie tego celu „pozwoli wreszcie zrealizować w pełni zamierzenia Human Genome Project”.
Niezależnie od potencjału, jaki niekodujące RNA ma dla medycyny, trwają wciąż dyskusje nad tym, czy rzeczywiście jest ono tak ważne dla naszych komórek. Do sceptyków zaliczają się genetycy Chris Ponting z University of Edinburgh i Wilfried Haerty z Earlham Institute w Norwich w Anglii. W artykule z 2022 roku przekonywali, że większość lncRNA to tylko „transkrypcyjny szum”, skutek przypadkowej transkrypcji losowych fragmentów DNA. „Stosunkowo niewielka część ludzkiego lncRNA […] ma istotny wpływ na rozwój, fizjologię lub zachowania człowieka” – napisali.
Brennecke zaleca ostrożność wobec obecnych wygórowanych szacunków dotyczących liczby genów niekodujących. Wprawdzie zgadza się, że takie geny „przez długi czas pozostawały niedoceniane”, mówi jednak, że nie powinniśmy teraz nagle zacząć zakładać, że wszystkie cząsteczki lncRNA pełnią jakieś funkcje. Wiele z nich ulega transkrypcji tylko w małej liczbie, czego można byłoby się spodziewać, jeśli faktycznie stanowią tylko przypadkowy szum. Genetyk Adrian Bird z University of Edinburgh wskazuje, że liczba cząsteczek zdecydowanej większości rodzajów ncRNA wydaje się średnio kształtować znacznie poniżej jednej cząsteczki na komórkę. „Trudno wyobrazić sobie, aby ncRNA mogło pełnić kluczowe funkcje, jeśli większość komórek go nie zawiera” – mówi.
Gingeras odpowiada jednak, że niski poziom ekspresji może odzwierciedlać bardzo swoiste dla poszczególnych tkanek działanie ncRNA. Niektóre z nich ulegają jego zdaniem silniejszej ekspresji w określonych częściach tkanek, co świadczy, że poziom ekspresji w poszczególnych komórkach zależy od czynników pochodzących z otaczających tkanek. Lawrence wskazuje, że niezależnie od niskiego poziomu ekspresji, schemat ekspresji jest często wspólny dla komórek określonego typu, trudno więc utrzymywać, że transkrypcja ma charakter czysto losowy. Z kolei Hall wątpi, czy komórki są tak kiepskie w „prowadzeniu własnego gospodarstwa”, aby powszechnie produkować mnóstwo bezużytecznego RNA. Lawrence i Hall sugerują, że niektóre lncRNA wywierają kolektywne działanie na strukturę chromatyny, co oznaczałoby, że nie ma potrzeby wysokiej ekspresji poszczególnych, a ich precyzyjna sekwencja nie ma zbytniego znaczenia.
Dinger uważa, że nieswoistość sekwencji i obiektów działania oznacza, iż mutacja nukleotydu w ncRNA nie będzie miała zazwyczaj tak negatywnego wpływu na jego funkcjonowanie, jak to jest w przypadku sekwencji DNA kodujących białka. Dlatego nie byłaby niczym zaskakującym spora zmienność sekwencji. Według Dingera bardziej uzasadnione byłoby założenie, że „cząsteczki zakodowane genetycznie mają jakieś działanie, chyba że zostanie wykazane inaczej, niż że są śmieciem, jeśli nie udowodni się ich funkcjonalności”. Niektórzy członkowie zespołu ENCODE zgadzają się obecnie co do tego, że nie całe 75% ludzkiego genomu ulegającego transkrypcji musi mieć praktyczne znaczenie. Wielu naukowców wskazuje jednak, że z pewnością dużo więcej cząsteczek niekodujących ma istotne działanie, niż wcześniej sądzono.
Wykazanie działania lncRNA często jest trudne. Według Gingerasa może to częściowo wynikać z faktu, że lncRNA nie zawsze jest w danym procesie cząsteczką aktywną biochemicznie: może ulegać rozcięciu na krótkie odcinki RNA, które faktycznie odpowiadają za jego działanie. Jednak ponieważ długie i krótkie RNA są opisywane z użyciem różnych technik, badacze mogą szukać niewłaściwych cząsteczek. Co więcej, długie RNA jest często rozcinane na fragmenty, które następnie są znowu łączone ze sobą w różnych kombinacjach, a konkretna kolejność może zależeć od stanu komórki, w jakiej zachodzą te procesy.
U podstaw kontrowersji wokół niekodującego RNA leży częściowo pytanie, co kwalifikuje cząsteczkę jako „funkcjonalną”. Czy kryterium powinno dotyczyć utrzymania sekwencji pomiędzy gatunkami? Albo występowania możliwych do stwierdzenia zmian w cechach organizmu, jeśli dana cząsteczka zostanie z niego wyeliminowana? Czy też wykazania jej udziału w jakichś procesach biochemicznych zachodzących w komórce? Czy jeżeli powtarzające się odcinki RNA działają kolektywnie jako „rusztowanie” dla chromosomów albo jeśli cząsteczki miRNA działają jako swego rodzaju regulacyjny rój, to można którąkolwiek z nich oddzielnie uznać za pełniącą pewną „funkcję”?
Gingeras jest skonsternowany ciągłymi twierdzeniami, że ncRNA są jedynie szumem lub śmieciami, ponieważ coraz więcej wyników badań wskazuje na to, że mają one wiele zadań. „Zastanawiające jest, dlaczego podejmuje się wysiłki, aby przekonać kolegów do porzucenia zainteresowania cząsteczkami ncRNA na rzecz podejścia bardziej nieufnego i krytycznego” – mówi.
Być może dyskusje są tak zacięte, ponieważ podważają nasze wyobrażenie na temat tego, jak działa biologia. Od czasu epokowego odkrycia podwójnej helisy DNA i sposobu, w jaki koduje ona informacje, podstawową koncepcją biologii molekularnej było to, że istnieją precyzyjnie zakodowane instrukcje, które programują określone cząsteczki do określonych zadań. Tymczasem ncRNA zdaje się wskazywać na rozmytą, kolektywną logikę życia. Tę logikę trudniej jest opisać i zrozumieć. Jeśli jednak badacze pogodzą się z tym rozmyciem, takie podejście może okazać się bardziej kompletne.