Szybka odpowiedź
Kiedy po raz pierwszy zaatakował nas COVID, na wyniki bardzo czułych laboratoryjnych badań metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction, PCR) trzeba było często czekać kilka dni. Później rozpowszechniły się szybsze testy do użycia przez każdego, jednak były zdecydowanie mniej dokładne. Nowe badania torują drogę dla badań diagnostycznych równie szybkich i prostych, jak błyskawiczne testy na COVID, a jednocześnie tak precyzyjnych, jak technika PCR.
Naukowcy dostosowali już wcześniej technikę edytowania genów CRISPR na potrzeby rozpoznawania materiału genetycznego patogenów takich, jak wirus SARS-CoV-2, który wywołuje COVID. Jednak większość tych prób obejmowała wzmacnianie lub „wstępne powielanie” DNA lub RNA, którego poziom mierzono, a ten etap wymagał specjalnego oprzyrządowania i przeszkolenia personelu.
W badaniu, które zostało ostatnio opisane w „Nature Communications”, pokazano, w jaki sposób badania oparte na technice CRISPR pozwalają na wykrywanie SARS-CoV-2, a także niebezpiecznych bakterii i mutacji nowotworowych z czułością podobną do techniki PCR bez potrzeby wstępnego powielania materiału.
W technice CRISPR wykorzystuje się enzymy tnące, połączone z cząsteczkami RNA dopasowanymi do docelowej sekwencji genetycznej (w tym przypadku sekwencji patogenu, którego szukamy). RNA „nakierowuje” enzym na cel, a następnie powoduje jego aktywację, dzięki czemu enzym rozcina docelową sekwencję. Niektóre warianty enzymu CRISPR na tym nie kończą: po aktywacji rozcinają wszelkie znajdujące się w okolicy jednoniciowe DNA (single-stranded DNA, ssDNA). Naukowcy mogą wykorzystać to działanie, tworząc test w taki sposób, aby przecinanie ssDNA prowadziło do fluorescencji potwierdzającej obecność patogenu, na który nakierowany był enzym CRISPR.
Jednak przy takiej konstrukcji każda cząsteczka docelowego DNA lub RNA aktywuje tylko jeden tnący enzym. W celu wzmocnienia sygnału opiekunka naukowa tego projektu, Ewa M. Goldys, specjalistka inżynierii biomedycznej z University of New South Wales w Sydney, stworzyła wraz ze swoimi współpracownikami maleńkie „nanookręgi” DNA o krótkiej, jednoniciowej sekwencji, wiążące się z obydwoma końcami docelowej sekwencji. W formie okrężnej nici te nie aktywują enzymów CRISPR. Jednak po rozcięciu rozwijają się do postaci liniowego DNA, wykrywanego przez CRISPR, i w reakcji łańcuchowej aktywują jeszcze więcej enzymów. „Patogen łatwo więc wykryć nawet w obecności jedynie kilku jego cząsteczek docelowych” – mówi Goldys.
Dzięki tej strategii czułość testów opartych na CRISPR wzrasta milion razy. „Przez eliminację wstępnego etapu powielania uzyskujemy eleganckie, proste rozwiązanie chemiczne, które może być łatwiejsze do wykorzystywania bezpośrednio przy pacjencie” – mówi Jonathan Gootenberg, biolog z Massachusetts Institute of Technology, który brał udział w tworzeniu wcześniejszych wersji testów diagnostycznych opartych na CRISPR. To nowe rozwiązanie może pozwolić wytwarzać tanie komponenty zestawów testowych, m.in. testów płytkowych, podobnych do szybkich testów na COVID kosztujących kilka dolarów.
Opracowane przez naukowców testy oparte na nanookręgach wykrywały materiał genetyczny SARS-CoV-2 i bakterii Helicobacter pylori wywołujących wrzody. Pozwalały także na wykrywanie DNA nowotworowego obecnego we krwi myszy i w osoczu człowieka. Takie testy można przeprowadzić w ciągu 15 min, podczas gdy testy PCR zwykle zajmują co najmniej godzinę. „Jesteśmy przekonani, że opracowaliśmy technikę, która ma realne szanse zastąpić PCR” – mówi Goldys.
Grupa współpracuje z partnerami komercyjnymi nad diagnostyką wirusologiczną i wykrywaniem pasożytów w wodzie. Pierwszym produktem są jednak zasobniki z nanookręgami ogólnego użytku, które badacze mogą dodawać do dotychczasowych testów opartych na CRISPR w celu zwiększenia ich czułości. Te okręgi mogą zawierać własne naprowadzające RNA, które ukierunkowuje DNA pochodzące z okręgów po ich rozwinięciu.
Największą przeszkodą będzie jednoczesne wykrywanie różnych cząsteczek. Taka funkcja jest często niezbędna w zastosowaniach medycznych (zwykle do weryfikacji prawidłowego działania testu), Gootenberg mówi jednak, że trudno będzie to osiągnąć. „Nie wiemy, jak sobie poradzimy z tym wyzwaniem – mówi Goldys – ale będziemy próbować”.